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细胞破碎仪---微射流高压均质机的一种应用方式

作者:苏州微流纳米生物 日期:2019-10-11 点击:222
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配备第二代微射流金刚石交互容腔的微射流高压均质机,因微射流金刚石交互容腔内部特殊的构造以及反应时超过音速的微射流对撞,使得微射流高压均质机具有极高的物料均质与破碎效率,除了用于纳米药物的制备,还可以作为高效的细胞破碎仪,本文将简介微射流高压均质机作为细胞破碎仪的一种应用。

红色诺卡氏菌细胞壁骨架(N-CWS)具有调节机体免疫的功能,能增强T细胞、NK细胞、白细胞的活性,并能诱导机体产生干扰素等细胞因子。通过多年的实验及临床研究证明它具有抗肿瘤作用,目前其细胞壁骨架主要由红色诺卡氏菌经破碎、提取和提纯后得到。常见的细胞破碎方法主要有超声波、反复冻融、酶解法及高压均质等。目前对红色诺卡氏菌细胞壁破碎主要采取超声波破壁的工艺,该工艺具有规模小、效率低、金属钛片污染风险高等缺陷。本文将介绍采用高压均质机破碎红色诺卡氏菌,制备细胞壁骨架,为该药品的生产工艺创新提供参考依据。

 

材料与仪器

红色诺卡氏菌(Nocadia rubra)PO-8;

细胞破碎仪(超高压纳米均质机 NanoGenizer30K);

光学显微镜;

PhenomproX台式扫描电子显微镜等。

实验方法

1. 红色诺卡氏菌高压均质破壁实验

取-20℃储存备用的菌体,置室温解冻30min。用生理盐水洗涤,4200r/min离心20min,收集后置于4℃备用。采用高压均质机对上述菌液,进行一定均质压力的循环破壁处理,分别对破壁条件压力、温度与循环次数、浓度进行实验,探讨这些因素对破壁效果的影响。

2. 碎片的收获

破壁处理菌液1700r/min,20min离心,收集菌体与上清。上清16000r/min、20min离心,弃上清,收集沉淀即碎片,用生理盐水清洗一次,16000r/min、20min离心收集,60℃干燥过夜,收集备用。

3. 均质破壁菌体的形态观察

取原菌液、高压均质后的菌液和碎片,采用美蓝染色,在光学显微镜下观察;分别取超声破壁和高压均质破壁收集到样本,经制片,在台式扫描电子显微镜上进行观察。

结果与分析

1. 均质压力对高压均质菌体破碎率的影响

高压均质的实质就是采用高压处理细胞,因此不同压力对菌体的破碎率的影响必然不同。由图1可以表明,在温度为25℃的条件下,随着压力的上升,菌体的破碎率随之上升,随着压力的上升破碎率上升的速率逐渐减小。本实验由于受到仪器制约,无法达到更高的压力。而且过高的压力在产业化生产中是不切实际的。图2可以表明高压均质压力达到2250bar时破碎率最高。

压力对高压均质菌体破碎率影响

图1 压力对高压均质菌体破碎率影响

循环次数对高压均质军体破碎率的影响

图2 循环次数对高压均质军体破碎率的影响

2. 温度与循环次数对高压均质菌体破碎率的影响

由图2可以表明,1800bar(无控温)循环3次和6次的细胞破碎率相差不是很大,而2250bar(控温25℃)循环3次和6次的细胞破碎率基本没什么差别。由图3可以表明,1800bar(无控温)与1800bar(控温)、2250 bar(无控温)与2250bar(控温)的菌体破碎率影响较大。

温度对高压均质机菌体破碎的影响

图3 温度对高压均质机菌体破碎的影响

3. 菌体浓度对高压均质菌体破碎的影响

由图4可以表明,菌体浓度对于高压均质的破碎率影响不大,菌体浓度为10%的破碎率仅略高于浓度为15%。由于浓度过高会造成仪器堵塞,而且不利于高压均质,在生产上会造成破碎率低下,仪器损耗过大。而浓度过低,会导致每次收集到的碎片的质量偏少,使得用更多的能耗来达到目标质量,也不利于产业化生产。因此本实验采用10%与15%的浓度进行研究,结果显示10%与15%的浓度对菌体的破壁率影响不大。综合考虑,采用15%的浓度更加高效合理。

浓度对高压均质机菌体破碎的影响

图4 浓度对高压均质机菌体破碎的影响

4. 光学显微镜的形态观察

通过涂片观察,结果显示未处理菌液中,基本上都是杆状的菌体,而且大部分菌体团聚成团,形成较大的菌团;经过高压均质后,多形成分散的形态,离心收集的碎片形态细小,且相对较为均匀(图略)。

5. 扫描电子显微镜的形态观察

对破壁的样品进行制片观察,结果见图5和图6, 表明普通超声破壁产生的碎片颗粒较大,而高压均质破壁产生的碎片颗粒较小。超声破壁具有较强的物理作用,在一参数下,由于受到的物理作用不均匀,造成菌体破碎不完全,碎片较大。而高压均质破壁通过压力对菌体进行处理,保证了每个菌体所受到的物理作用相对均匀,因此碎片颗粒较小,菌体破碎效果也较好。

超声波破壁菌样(15000倍)

图5 超声波破壁菌样(15000倍)

高压均质破壁菌样(15000倍)

图6 高压均质破壁菌样(15000倍)

 

结 论

高压均质机作为细胞破碎仪用于细胞破壁,均质压力对于细胞破碎率的影响很大,高压力的破碎效果较好;无控温将会影响破壁效果,高温可能会对收集碎片的质量产生较大影响。菌体浓度10%与15%,对于菌体的破碎率影响不大。经过高压均质处理后,大多数细胞破碎,收集到的碎片多呈细小状,且更加均匀,总体效果更好。

初步研究结果表明,红色诺卡氏菌高压均质破碎适宜的工艺参数为:压力2250bar,控温25℃,循环次数3次,菌体浓度15%。


微射流高压均质机工作原理与特性介绍.pdf

苏州微流纳米Vic 

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