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微射流高压均质技术应用于一种生物碱脂质体制备

作者:www.willnano.com 日期:2022-03-20 点击:603
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脂质体主要由磷脂和胆固醇组成,是两亲性分子的集合,粒径、电荷、成分和分子结构容易控制,且可生物降解,免疫原性小、无毒;可包载水溶性和脂溶性药物,使药物缓慢释放;脂质体通过细胞的内吞和融合作用,直接将药物送入细胞内,减少不良反应,因此脂质体是较理想的靶向载药体系。近年来随着生物科学技术的不断发展,脂质体的制备工艺逐步完善,脂质体具有优良的生物相容性、靶向性、长效缓释性、低毒性等优点,能提高药物的稳定性和治疗指数并且降低药物毒性,因此,脂质体作为药物载体的研究越来越受到重视,且取得了可喜的进展。目前已有紫杉醇脂质体上市,如南京绿叶思科公司的注射用紫杉醇脂质体和美国AbraxisBioScience公司的注射用紫杉醇(白蛋白结合型);德国Medigene公司研制的代号为EndoTAG-1的紫杉醇脂质体和美国的Neopharm公司研制的代号为LEP-ETU的紫杉醇脂质体正处于临床研究阶段。

肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,死亡率居恶性肿瘤的第3位,仅次于胃癌和食管癌。现代综合治疗方法常限制在放、化疗和免疫治疗上,但是放、化疗对肝癌的治疗毒副反应极大,适应证减少,疗效也差。寻找治疗癌症的新方法和新途径是目前亟需解决的问题。将抗癌药物研制成靶向给药系统,从技术上可将药物特异性的输送、浓集于靶区病变部位,提高药效,降低毒副作用。

本研究目的是将一种光谱抗癌的生物碱A利用高压微射流技术制备成粒径为100-200nm的脂质体,生物碱A是具有明确抗肿瘤作用的中药活性物质,但由于其水溶性极差,生物利用度低,限制了其在临床的应用,而制成脂质体后的剂型,通过血液循环蓄积于肝脏,达到靶向治疗肝癌的作用。将生物碱A包封在脂质体内,可显著增加药物的稳定性,降低毒副作用,增加生物利用度,达到靶向缓释的作用。

本文将简介生物碱A脂质体处方优化过程


实验设备:

1260型高效液相

电子天平

旋转蒸发器

激光粒度分析仪

微射流高压均质机

 

实验方法:

初乳制备方法的筛选

(1)薄膜分散法

精密称取生物碱A 10mg、磷脂500mg、胆固醇40mg、VE40mg,加入氯仿使其溶解,过滤后转移至250mL茄形瓶中,40℃水浴条件下减压蒸发除去有机溶剂,至瓶壁上形成均匀的脂质薄膜,用氮气去除残留溶剂。加入15mLPBS(pH7.0)和玻璃珠,35℃水浴条件下旋转水合,直至薄膜脱落溶解,得生物碱A脂质体粗悬液,超声后经高压微射流仪均质处理,即得生物碱A纳米脂质体。

(2)逆相蒸发法

精密称取生物碱A 10mg、磷脂500mg、胆固醇40mg、VE40mg溶于乙醚中,过滤后加入适量PBS(pH7.0)缓冲液超声,直至形成比较稳定的W/O型乳液,减压蒸发除去乙醚使之处于胶态后,加入PBS缓冲液水化使凝胶脱落,继续减压蒸发,制得水性混悬液,超声后经高压微射流均质处理即得生物碱A纳米脂质体。

(3)乙醇注入法

精密称取生物碱A 10mg、磷脂500mg、胆固醇40mg、VE40mg溶于乙醇中,过滤去除少量不溶性成分,缓慢注入60℃的PBS缓冲液中,磁力搅拌下挥尽乙醇,超声,经高压微射流均质处理即得生物碱A纳米脂质体。

(4)乙醚注入法

精密称取生物碱A 10mg、磷脂500mg、胆固醇40mg、VE40mg溶于乙醚中,过滤去除少量不溶性成分,缓慢注入40℃的PBS缓冲液中,磁力搅拌下挥尽乙醚,超声,经高压微射流均质处理即得生物碱A纳米脂质体。

根据脂质体悬液的性质,设定以下几个指标来考察工艺的好坏:①粒径大小:依次经0.8µm、0.45µm的微孔滤膜过滤应无很大阻力,且滤膜上药物应残留少,过滤液与原液外观无很大差异,药物含量应该与实际投药量的比率高;②稳定性:放置24h,脂质体悬液应稳定,底部无沉淀;③包封率应较高。用上述四种方法分别制备3批脂质体,测定包封率,结果见表1

 表1不同制备方法评价

表1不同制备方法评价

由结果可知,四种方法制备的脂质体质量差异较大,薄膜分散法制得的脂质体包封率最高,粒径符合要求,稳定性最好,跟其他三种方法相比具有明显的优势;而且薄膜分散法应用最为广泛,尤其适用于包封脂溶性药物,设备易得、操作简单,因此采用薄膜分散法制备生物碱A脂质体。

单因素考察

有机溶剂筛选

精密称取生物碱A 10mg、磷脂500mg、胆固醇40mg、VE40mg,分别用甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙醚、氯仿充分溶解,成膜温度为40℃,pH7.0的PBS缓冲液制备脂质体,以包封率、脂质膜的形成时间和均匀度为考察指标,筛选有机溶剂。结果见表2。

 表2不同溶剂对脂质体包封率的影响

表2不同溶剂对脂质体包封率的影响

由结果可知,甲醇、乙醇制备的脂质体包封率较低,且制备过程中磷脂不易溶于甲醇和乙醇,需要超声,且需要较高的水浴温度才能除尽乙醇,可能导致磷脂氧化,脂质膜部分颜色发黄。相比甲醇、乙醇、二氯甲烷,用氯仿和乙醚制备的脂质体有较高的包封率,但是考虑氯仿毒性较乙醚大,乙醚极易挥发,旋蒸易得到光滑的脂质薄膜,故确定乙醚作为有机溶剂。

成膜温度考察

精密称取生物碱A 10mg、磷脂500mg、胆固醇40mg、VE40mg,用乙醚充分溶解,考察温度为30℃、35℃、40℃、45℃时,pH7.0的PBS缓冲液制备脂质体,以包封率、脂质膜的形成时间和均匀度为考察指标,筛选成膜温度。结果见表3。

 表3不同成膜温度对脂质体包封率的影响

表3不同成膜温度对脂质体包封率的影响

 由结果可知,当成膜温度为45℃时,乙醚挥发较快,导致磷脂膜起泡,脂质膜的质量较差,而且高温会加速磷脂的氧化,导致包封率降低;成膜温度为35℃时,成膜速度适中,脂质膜均匀、透明,包封率较高,最终确定成膜温度为35℃。

PBS缓冲液的pH

精密称取生物碱A 10mg、磷脂500mg、胆固醇40mg、VE40mg,用乙醚充分溶解,成膜温度为35℃,分别用pH为6.5、7.0、7.4的PBS缓冲液制备脂质体,以洗膜时间、稳定性和包封率为考察指标,确定pH。结果见表4。

 表4PBS缓冲液的pH考察

表4PBS缓冲液的pH考察

PBS缓冲液的pH不同导致药物带电量不同,从而影响脂质体表面药物的吸附量、脂质体的表面电动电位以及稳定性,由结果可知,pH7.4的PBS缓冲液制备脂质体时,28min即洗膜完全,可以防止磷脂氧化并且缩短实验周期,制得的脂质体放置24h稳定,包封率较高,最终确定PBS缓冲液的pH为7.4。

磷脂与药物的质量比考察

固定上述条件不变,比较磷脂(W1)与药物(W2)的质量比为15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1时对制剂包封率的作用大小,结果见图1

 图1磷脂与药物的质量比考察结果

图1磷脂与药物的质量比考察结果

由结果可知,磷脂与药物的比例对包封率作用明显,磷脂对药物的承载能力有限,如果生物碱A投药量太大,脂质囊材没有足够的空间来包封大量的药物,造成包封率降低,甚至导致药物析出;如果投药量太小,包封率高但是载药量小。而且脂药比为15:1制备的脂质体稳定性较差,放置10h即出现沉淀,因此将磷脂与药物的比例作为星点-响应面法优化工艺的因素之一继续考察。

磷脂与胆固醇的质量比考察

固定上述条件不变,比较磷脂(W1)与胆固醇(W3)的质量比为2:1、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1时对包封率的作用大小,结果见图2。

 图2磷脂/胆固醇考察结果

图2磷脂/胆固醇考察结果

由结果可知,磷脂/胆固醇对包封率作用非常明显,随着胆固醇比例的减小,包封率呈现先增大后减小的趋势,在膜材比为10:1时达到最大。可能是由于胆固醇可以调节磷脂的流动性,稳定脂质双分子膜,但其所占比例过大时,其在脂质双层膜中占据一定的空间,干扰脂质囊泡的形成,导致包封率下降。因此,选择合适的磷脂/胆固醇,对脂质体载药量以及脂质体的稳定性都有重要的影响,将磷脂/胆固醇作为星点响应面法优化工艺的因素之一继续考察。

 

磷脂与VE的质量比考察

固定上述条件不变,比较磷脂(W1)与VE(W4)的质量比为2:1、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1时对包封率的作用大小,结果见图3。

 图3磷脂与VE的质量比考察结果

图3磷脂与VE的质量比考察结果

由结果可知,磷脂与VE比例为15:1时,包封率最高。VE虽具有抗氧化功能,可以减少磷脂的氧化和有毒物质的产生,增强脂质体膜的稳定性,因此需要VE比例越高,抗氧化能力越强,但是如果其比例过大,就会似胆固醇一样占据脂质双层膜的空间,导致包封率明显减小。为了尽可能减小磷脂的氧化,提高脂质体的稳定性而不影响包封率,选择磷脂与VE比例为15:1。2.2.7磷脂浓度考察固定上述条件不变,比较磷脂浓度为10、20、30、40、50mg·mL-1时对包封率的作用大小,结果见图4。

 图4磷脂浓度对脂质体包封率的影响

图4磷脂浓度对脂质体包封率的影响

由结果可知,随着磷脂浓度的增加脂质体的包封率先增大后减小。磷脂浓度太低则包封药物的能力较弱,但磷脂浓度50mg·mL-1时,包封率明显减小,而且脂质体浓度太高,容易发生聚集,稳定性降低。磷脂浓度对包封率影响显著,因此将其作为星点-响应面法优化工艺的因素之一继续考察。

 

第二部分制备工艺优化过程将在下文中继续介绍。

 

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