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微流控纳米粒度仪在药物亚微米颗粒监控中的应用

作者:www.willnano.com 日期:2022-07-24 点击:461
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生物材料的治疗和诊断应用正在激增,包括用于直接治疗药物递送的抗体和抗体药物偶联物,用于药物递送新基因疗法的病毒,以及用于药物递送复杂治疗信号剂的细胞外囊泡。值得注意的是,每一类材料都包含一个具有纳米级尺寸的关键组件,在某些情况下包括运载工具本身,在许多情况下还包括不需要的聚集体。在所有的开发阶段,对这些材料中所需的和假的纳米颗粒成分进行定量,对于正确评估有效性和确保产品安全性是至关重要的。因此,亚微米尺寸范围内生物纳米颗粒的精确物理表征是给药物递送行业越来越重要的要求。

而生物纳米颗粒的粒径与浓度测量始终对设备的要求越来越高。


生物纳米颗粒的精确测量

一般来说,随着亚微米颗粒的尺寸减小,其测量信号降低到测量仪器的检测极限,其精确测量变得越来越困难。虽然低温透射电子显微镜(CryoTEM)仍然是确定纳米颗粒尺寸的金标准,该技术的亚纳米尺寸分辨率使它作为一种偶尔的分析工具非常强大,但这种技术的成本和速度慢使其不适合常规使用。历史上,亚微米尺寸范围内最常用的粒子测量技术是光学技术,如动态光散射(DLS)、纳米颗粒跟踪分析(NTA)和流式细胞术(FC)。

然而,生物纳米颗粒有三个共同的特征,这使得它们非常难以使用光学技术进行测量,主要是因为这些测量依赖于检测从这些非常小的粒子中散射的光。

首先,散射光的强度显著降低,与直径的六次方相关。因此,100纳米粒子的散射光比1µm粒子少100万倍。这种依赖性,再加上光学传感器有限的动态范围,限制了可以在单个样品中测量的实际尺寸范围,并使小粒子的检测更具挑战性。

其次,大多数生物材料的物理组成导致产生的粒子折射率与周围的介质相似,通常是水介质,在某些情况下,指数相差只有几个百分点。散射光强度与这个指数差(也称为对比度)成正比,因此可以导致信号再次减少10到100倍。低折射率对比度和小尺寸的结合显著削弱了从生物纳米粒子散射的光的强度,从而限制了光学测量技术对这些亚微米粒子的灵敏度。

最后,生物纳米颗粒的复杂起源(例如,聚集过程或从细胞中脱落)产生了具有不同的材料组成和广泛的颗粒尺寸的真实样本。高度的多分散性在这些样品地方重大负担大小分辨率的情况下,测量散射光从单一粒子,并提出了一个不可逾越的障碍,执行集成测量的所有粒子入射光路径和不能容忍显著的多分散性。

 

测量纳米颗粒大小和浓度的非光学技术为这些光学技术提供了一种强有力的替代方法。最常见的是基于一种被称为电阻脉冲传感(RPS)的电学测量技术,在历史上被称为库尔特原理,以该技术的发明者华莱士·库尔特原理命名。

RPS是一种被证明的测量大颗粒(>1µm)大小和浓度的技术,几十年来一直是全血细胞计数的金标准。RPS非常适合用于生物纳米颗粒的测量,原因有三:

1。检测信号随粒子体积呈线性关系,因此在单个样本中可以测量的动态尺寸范围要大得多。

2. RPS的测量与粒子的材料组成无关,因此不像光学技术那样遭受灵敏度的损失。

3. 由于粒子在RPS中以高精度单独测量,高多分散性不是一个重要的问题。可以直接在复杂的介质中直接进行颗粒测量,如血清、尿液和其他生物液体,这些液体的多分散性会混淆光散射技术。


那么,为什么RPS的使用在历史上仅限于大粒子呢?RPS要求所有被测量的粒子都通过物理收缩进行检测,并且必须减少物理收缩的尺寸才能检测到更小的粒子。现实世界的样品包含的颗粒浓度大于纳米颗粒测量所需的小收缩尺寸。因此,在最简单的RPS实现中,样品中的大颗粒会导致收缩的频繁阻塞,并禁止了该技术的实际应用。

2009年,为了早期尝试克服这一障碍,Izon科学公司(克赖斯特彻奇,新西兰)开发了用于RPS测量的qNano。Izon的实现设置了可变形膜(“可调”RPS)的收缩,可以调整,允许阻塞在恢复测量之前通过。虽然该技术已被许多学术出版物引用,但它在需要高通量和交钥匙操作的工业应用中的部署受到了限制。

最近,Spectradyne将一种不同的RPS方法商业化,显著提高了在工业环境下对真实样品进行常规纳米颗粒分析技术的实用性。Spectradyne公司的nCS1仪器是RPS(MRPS)的微流控实现,利用半导体行业的制造技术,将一些流控特性纳入一次性分析盒,允许纳米颗粒分析,同时显著减少堵塞事件。MRPS可以直接测量高度多分散的生物纳米颗粒样品,如蛋白质聚集物、血清、尿液和细胞外囊泡的粗制剂,并正在被制药行业的著名研究人员所采用。

不管仪器的基本工作原理如何,所有仪器最终都受到其固有灵敏度和噪声的限制。但随着生物纳米颗粒的重要性在药物输送行业,监管机构如美国FDA越来越认识到使用一套完整的描述方法的重要性,由苏珊·科什纳,博士,在2012年的谈话题为“监管期望聚合和粒子的分析”,包括方法正交于传统的光技术。MRPS代表了一种实用且易于使用的替代方案。


MRPS测量实例

下面给出了三个测量例子,说明了上述考虑在现实世界的给药行业应用中的重要性。首先,比较三种不同的粒子分析方法(NTA、CryoTEM和MRPS)对简单的胞外囊泡制备进行测量,以显示使用正交测量技术的重要性。其次,用NTA和MRPS测量一个聚集的蛋白样本,并说明了上述仪器的限制如何适用于不同类别的样本。最后,利用一系列应激蛋白样本的测量来证明MRPS较小的颗粒检测极限如何能够更早地检测蛋白质聚集。

例1:除非仔细纯化,否则细胞外囊泡(ev)样品自然表现出颗粒浓度与颗粒大小的近似幂律分布。如此宽的粒径分布提供了一个极好的机会来评估不同测量技术在相关样品类型的综合尺寸范围内的灵敏度。对于这个测量示例,我们使用MRPS、NTA和CryoTEM分析了来自人类无细胞尿液中的一个简单的ev样本(图1)。


图1:使用三种正交技术:MRPS、CryoTEM和NTA测量从人血清中分离的细胞外囊泡。与MRPS和金标准CryoTEM等正交技术相比,光学技术对小的、弱散射的生物纳米颗粒的灵敏度损失变得很明显。

图1:使用三种正交技术:MRPS、CryoTEM和NTA测量从人血清中分离的细胞外囊泡。与MRPS和金标准CryoTEM等正交技术相比,光学技术对小的、弱散射的生物纳米颗粒的灵敏度损失变得很明显。

 

MRPS显示了浓度与颗粒大小的明显幂律依赖性,并延伸到50nm,这是本测量中使用的分析盒的检测极限。重要的是,MRPS的测量结果与CryoTEM的测量结果非常一致,这是测量这类样品中颗粒大小和相对浓度的金标准。

NTA的测量结果突出了NTA技术在检测这类样品中的小颗粒方面的局限性。NTA明显低估了较小颗粒的浓度,与CryoTEM的结果变得明显,从200nm开始,在150nm以下显著增加。NTA和CryoTEM之间的差异在150nm直径以下扩展到几个数量级。

因此,研究人员在解释这些NTA数据时必须小心,特别是结果的剖面似乎表明在150nm左右的尺寸分布中存在一个峰值,这并不是粒径分布的真正特征。只有在使用MRPS或CryoTEM等正交方法进行比较时,峰值才能被准确地识别为测量技术的人工产物,如本例中所述。不幸的是,不准确的基于光学的EV尺寸分布测量,如NTA测量,经常出现在文献中,通常没有正交技术,如MRPS或CryoTEM支持。


例子2:蛋白质聚集在聚集过程中,直径为几纳米的蛋白质单体聚集成二聚体、三聚体,然后聚集成更大的颗粒,直径可达几十微米。这个过程产生了一种含有颗粒的高度多分散的混合物跨越直径和浓度的许多数量级,具有物料浓度与颗粒大小的近似幂律分布。

在这个具体的例子中,在5 mg/mL的磷酸盐缓冲盐中制备了一个专有的蛋白质样品,并在高温下胁迫24小时以加速聚集过程。采用NTA和MRPS方法测量了样品中的粒径分布(图2)。MRPS测量结果显示了浓度对大小的预期幂律依赖性,并进一步表明幂律依赖性延伸到至少60nm,这是用于该测量的分析盒检测的小尺寸极限。


图2:当通过MRPS测量时,应激样品中的蛋白质聚集物显示了浓度与大小的预期幂律依赖性。NTA的灵敏度的大小范围是明显的,因为该方法低估了约150-450nm直径以外的浓度。

图2:当通过MRPS测量时,应激样品中的蛋白质聚集物显示了浓度与大小的预期幂律依赖性。NTA的灵敏度的大小范围是明显的,因为该方法低估了约150-450nm直径以外的浓度。


在本例中也清楚地说明了光学技术的灵敏度限制。虽然NTA很容易检测到样品中约150-450nm之间的粒子,但在150nm以下,NTA报告的浓度急剧下降(注意纵轴上的对数尺度),可能由于这些较小的蛋白质聚集物的散射强度降低。由于这种浓度与尺寸的明显下降,数据可能被错误地解释为尺寸分布的峰值。如果不使用MRPS等正交技术来验证粒度分布的真实性质,很多研究人员可能会被误导。


例3:MRPS可以更早地检测蛋白质聚集精确测量较小的生物纳米颗粒,如用MRPS获得的纳米颗粒,可以为真实的药物药物递送应用节省时间。在这个例子中,MRPS被用来量化应激药物配方中的蛋白质聚集物。结果表明,通过检测和分析较小颗粒的浓度,可以在过程中早期检测到应力诱导的聚集。

一种专有生物药物制剂的等分物被强调,时间从0分钟(对照)到60分钟不等,随后使用MRPS来量化每个样本中的聚集物(图3)。数据非常清楚地显示了预期的趋势:随着施加于样品的应力量的增加,样品中聚集物的浓度在所有颗粒大小中都在增加。


图3:应激样品中的蛋白质聚集显示出随着应激的增加而浓度增加的预期趋势。对三个粒径子范围的浓度测量(插图)表明,通过定量较小的聚集体,可以更早地检测到应力对样品的影响。

图3:应激样品中的蛋白质聚集显示出随着应激的增加而浓度增加的预期趋势。对三个粒径子范围的浓度测量(插图)表明,通过定量较小的聚集体,可以更早地检测到应力对样品的影响。

然而,重要的是,骨料浓度首先在小颗粒尺寸时增加,然后在大颗粒尺寸时增加。这种效应在数据中很明显,如图3中的插图所示。当在r1到r3(分别为小颗粒到大)上测量浓度时,在第一个时间点,仅在10 min后,应力对样品的影响是明显的。这种行为与预期是一致的,因为蛋白质聚集必须在生长到大尺寸之前开始小,并为配方开发节省时间提供了重要的机会。

使用精确的方法来定量较小的纳米颗粒,如MRPS,配方应力测试可以在很小部分的时间内进行,使用光学技术缺乏足够的灵敏度来检测较小的、早期阶段的聚集体。在工业环境中,在过程中更快地获得数据可以显著提高过程效率。

图 nCS1 微流控纳米粒度仪与微流控芯片样品池

图 nCS1 微流控纳米粒度仪与微流控芯片样品池


随着纳米级生物材料的治疗和诊断应用的激增,其准确的定量变得越来越重要。这篇文章表明,虽然普遍存在的,光学方法的纳米颗粒分析必须在完全了解其局限性的情况下使用,并且结论应该得到正交测量技术的结果的支持。所引用的例子说明了由于光学技术的灵敏度限制所造成的人工制品可能会误测复杂的生物纳米颗粒样品的真实组成。这些例子还表明,实用的技术,如MRPS,能够精确地定量测量亚微米生物粒子,并在现实世界的制药工业应用中提供了大量节省时间和金钱的机会。