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星点-响应面法优化生物碱脂质体微射流高压均质法制备工艺

作者:www.willnano.com 日期:2022-03-27 点击:531
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接上文 制备工艺优化过程本文中继续介绍。

制备方法

采用薄膜分散-微射流法制备脂质体:精密称取一定量的注射用磷脂、胆固醇、VE和生物碱A(磷脂与VE的质量比为15:1,其他比例见表1),加入适量乙醚振摇使其溶解,过滤后转移至250mL茄形瓶中,35℃水浴条件下减压蒸发除去有机溶剂,至瓶壁上形成均匀的脂质薄膜,用氮气去除残留溶剂。加入15mL的PBS缓冲液(pH7.4)和玻璃珠,35℃水浴条件下旋转水合30min,直至薄膜脱落溶解,得生物碱A脂质体粗悬液,适当超声后,经高压微射流仪12000psi压力下循环12次,依次过0.8、0.45µm的滤膜进行整粒,即得生物碱A纳米脂质体。

实验设计采用Design-Expert8.0.6软件进行响应面优化设计,实验因素和水平见表1,结果见表2

 表1星点-响应面法优化生物碱脂质体微射流高压均质法制备工艺实验因素及水平

表1实验因素及水平

表2 星点-响应面法优化生物碱脂质体微射流高压均质法制备工艺响应面分析方案及结果 

表2响应面分析方案及结果

 

模型及数据分析

对试验结果进行二次回归拟合,得出拟合方程:Y=-177.06+11.05A+2.54B+3.88C-0.02AB-0.01AC+5.83×10-3BC-0.17A2-0.07B2-0.04C2(R2=0.9855)其中Y为包封率。方差分析结果见表3

 表3 响应曲面模型方差分析表

表3 响应曲面模型方差分析表

 

由方差结果可知,该拟合方程的P<0.0001,具有极大的显著性,Lack of fit检验的P>0.05,说明没有失拟因素。三个因素对包封率都有较大的影响,其中磷脂浓度影响最大。拟合方程的R2=0.9855,表明该模型对生物碱A脂质体的制备具有较好的预测性。

 

响应曲面分析

因素C磷脂浓度为32.5mg·mL-1时,绘制A和B两个因素对包封率的三维响应图,如图1a;因素B磷脂与胆固醇的质量比为12.81:1时,绘制A和C两个因素对包封率的三维响应图1b,如图;因素A磷脂与药物的质量比为30:1时,绘制B和C两个因素对包封率的三维响应图,如图1c

 图1星点-响应面法优化生物碱脂质体微射流高压均质法制备工艺三维响应图

图1三维响应图

 

由对三组响应曲面图都比较陡峭可知,三个因素对包封率的影响较为显著,分析响应面结果,确定脂质体最佳处方为:A为30.58:1,B为15.22:1,C为42.26mg·mL-1。以此条件制备3批样品做验证试验,结果三批脂质体的平均包封率为92.89%,与预测值93.21%非常接近,表明该处方设计可信度较高。

本研究以包封率为指标,根据生物碱A的性质,比较了薄膜分散法、逆向蒸发法、乙醇注入法、乙醚注入法四种制备方法,最终确定用薄膜分散法制备生物碱A脂质体。以包封率为指标,单因素筛选有机溶剂,成膜温度,PBS缓冲液的pH,磷脂与VE、药物、胆固醇的比例和磷脂浓度等因素,其中磷脂与药物、胆固醇的比例和磷脂浓度。对包封率影响较大,将这三个因素采用Box-Benhnken模型进行三因素三水平的响应面试验,得出拟合方程:Y=-177.06+11.05A+2.54B+3.88C-0.02AB-0.01AC+5.83×10-3BC-0.17A2-0.07B2-0.04C2,该拟合方程的P<0.0001,具有极大的显著性。三个因素对包封率都有较大的影响,其中磷脂浓度影响最大。拟合方程的R2=0.9855,表明该模型对生物碱A脂质体的制备具有较好的预测性。参考其三维响应图确定制备工艺以获得最大包封率的脂质体,相对于传统的筛选方法具有较高的优越性。

最终制备工艺为采用薄膜分散-微射流法制备脂质体,磷脂浓度为42.26mg·mL-1,磷脂与生物碱A的质量比为30.58:1,磷脂与胆固醇的比例为15.22:1,磷脂与VE的质量比为15:1,有机溶剂为乙醚,成膜温度为35℃,PBS缓冲液的pH7.4,35℃水浴条件下旋转水合30min,适当超声后,经高压微射流仪120psig压力下循环12次,依次过0.8、0.45µm的滤膜进行整粒,即得生物碱A纳米脂质体。


制备样品粒径分布

取适量生物碱A脂质体,用蒸馏水稀释至适宜浓度后,用激光粒度分析仪测定其平均粒径及分布,结果见图2。

 图2生物碱A脂质体的粒径分布图

图2 微射流法制备生物碱A脂质体的粒径分布图

由结果可知,脂质体平均粒径为126nm,多分散系数PDI为0.139,生物碱A脂质体粒度分布较窄,符合肝靶向脂质体的粒度要求

 

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